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一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>
通過檢測(cè)處于凋亡狀態(tài)的細(xì)胞數(shù)量來檢驗(yàn)?zāi)康幕蚺c細(xì)胞凋亡的關(guān)聯(lián)或者藥物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。

二、實(shí)驗(yàn)原理
在正常的活細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸 (phosphotidylserine，PS) 位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡細(xì)胞中，PS 從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。

Annexin-Ⅴ能與 PS 高親和力結(jié)合。可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。用標(biāo)記了 FITC 的 AnnexinⅤ作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。細(xì)胞壞死的過程中也會(huì)發(fā)生細(xì)胞膜損傷，壞死的細(xì)胞會(huì)結(jié)合 Annexin V-FITC。

Annexin V-FITC 通常與細(xì)胞膜非滲透性核酸熒光染料聯(lián)合使用以檢測(cè)凋亡細(xì)胞。常用的染料是 PI。正常細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜是完整的，核酸染料 Propidium iodide(PI) 不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞，PI 能夠透過細(xì)胞膜與細(xì)胞核結(jié)合呈現(xiàn)紅色。

將 AnnexinⅤ與 PI 匹配使用，可以將凋亡早期的細(xì)胞和晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。壞死細(xì)胞可以同時(shí)與 Annexin V-FITC 和 PI 結(jié)合顯色，而 PI 則被排除在活細(xì)胞 (FITC 陰性) 和早期凋亡細(xì)胞 (FITC 陽性) 之外。在沒有巨噬細(xì)胞的情況下，凋亡的最后階段會(huì)像細(xì)胞壞死一樣發(fā)生整個(gè)細(xì)胞的解體，從而使凋
亡晚期的細(xì)胞也同時(shí)被 FITC 和 PI 結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性。

三、實(shí)驗(yàn)步驟
1. 待各實(shí)驗(yàn)組 6 孔板細(xì)胞生長至覆蓋率約為 70% 時(shí)，收集上清，胰酶消化貼壁細(xì)胞，完quan培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，與上清細(xì)胞收集于同一 5 mL 離心管中，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔 (為保證上機(jī)細(xì)胞數(shù)足夠，細(xì)胞數(shù)目 ≥ 5×105/處理）。若為懸浮細(xì)胞，直接收集。
2.1000 g 離心 5 分鐘，棄上清，用 PBS 輕輕重懸細(xì)胞；
3.1000 g 離心 5 分鐘，棄上清，加入 195μl Annexin V-FITC 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。
4. 加入 5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。
5. 加入 10μl 碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
6. 使用鋁箔進(jìn)行避光，室溫 (20-25℃) 避光孵育 10-20 分鐘，孵育過程中重懸細(xì)胞 2-3 次，隨后置于冰浴中。
7. 立即上機(jī)檢測(cè)

四、常見問題及解答
Q1：構(gòu)建了慢病毒轉(zhuǎn)染的穩(wěn)轉(zhuǎn)株（帶綠色熒光），檢測(cè)凋亡使用 FITC 也是綠色熒光，是否會(huì)干擾？
A：會(huì)有干擾，可以換紅色熒光標(biāo)簽的試劑進(jìn)行檢測(cè)。

Q2：鏡下觀察有很多漂浮細(xì)胞，可以看到凋亡，為什么染色后跑流式，凋亡比例跟 control 差不多？
A：將漂浮的細(xì)胞收集起來再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

Q3：Annexin V-FITC 和 PI 在激光共聚焦顯微鏡下分別選擇的測(cè)量波長是多少？
A：綠色熒光可以使用 488nm 激發(fā)，PI 是紅色熒光，使用 535nm 激發(fā)

Q4：FITC 和 PI 孵育時(shí)間過短，對(duì)結(jié)果有什么影響？
A：孵育時(shí)間過短，影響裝載效果，時(shí)間過長，也要考慮細(xì)胞本身的狀態(tài)。

Q5：想問一下用流氏檢測(cè)應(yīng)該怎么設(shè)門？
A：用陰性未染色的細(xì)胞調(diào)電壓，門設(shè)置，annexin V-FITC 單染、PI 單染來調(diào)補(bǔ)償。