一、實驗?zāi)康?/span>
通過檢測細(xì)胞活力來驗證目的基因?qū)?xì)胞增殖的影響,或驗證某種藥物對細(xì)胞的毒性。
二、實驗原理
Cell Counting Kit-8(簡稱 CCK8) 試劑中含有 WST-8?;罴?xì)胞特別是增殖期細(xì)胞的線粒體中的琥珀脫氫酶能夠使 WST-8 還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物(Formazan dye)。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比,用酶標(biāo)儀在 450nm 波長處測定其吸收值,即可間接反映細(xì)胞增殖情況。
三、實驗步驟
1. 將細(xì)胞以 104-105 個細(xì)胞/孔的密度接種在 96 孔板中,加入 100μL 培養(yǎng)基,含或不含待測化合物。在 CO2 培養(yǎng)箱中在 37℃ 下培養(yǎng)細(xì)胞 24 小時。
2. 向板中加入 10μL 不同濃度的待測物質(zhì)。
3. 在培養(yǎng)箱中將培養(yǎng)板培養(yǎng)適當(dāng)時間(如 6、12、24 或 48 小時)。
4. 向板的每個孔中加入 10μL CCK-8 溶液。小心不要將氣泡引入孔中。
5. 將平板在培養(yǎng)箱中孵育 1-4 小時。
6. 在讀板之前,在定軌振蕩器上輕輕混勻。
7. 使用酶標(biāo)儀測量 450nm 處的吸光度。
四、常見問題及解答
Q1:做細(xì)胞活性檢測時,每孔應(yīng)該接種多少個細(xì)胞?
A:當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn) 96 孔板時,貼壁細(xì)胞一般最小接種量為 1,000 個/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)。檢測白細(xì)胞時的靈敏度相對較低,因此推薦接種量不低于 2,500 個/孔 (100 μL 培養(yǎng)基),當(dāng)然,也有部分極其靈敏的試劑盒或可檢測更少量的細(xì)胞。
Q2:若是使用 6 孔或者 24 孔板進(jìn)行試驗,CCK 試劑使用量怎么樣呢?
A:如果要使用 6 孔板或 24 孔板實驗,請先計算每孔相應(yīng)的接種量,并按照每孔培養(yǎng)基總體積的 10% 加入 CCK8 溶液。
Q3:培養(yǎng)基的本底顏色如酚紅會不會影響細(xì)胞活性的檢測呢?
A:不會的,培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計算時,通過扣除空白孔中本底的吸光值而消去,因此不會對檢測造成影響。
Q4:只可以在 450nm 波長處測 OD 值嗎?
A:可以在 450nm 波長處測 OD 值,但是若無此波長的濾光片,可選擇吸光度在 430-490 nm 之間的濾光片,但是 450 nm 濾光片的檢測靈敏度最高。
Q5:若是暫不檢測 OD 值,該如何處理?
A:若暫時不測定 OD 值,可以向每孔中加入 10 μL 0.1 M 的 HCL 溶液或者 1% w/v SDS 溶液,并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24 小時內(nèi)測定,吸光度不會發(fā)生變化。
Q6:在實驗中 OD 值太高,怎么解決?
A:CCK-8 試劑后的培養(yǎng)時間由 2 小時縮短為 1 小時。此外,可適當(dāng)減少細(xì)胞的數(shù)量。
Q7:應(yīng)該每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線嗎?
A:建議每次做。雖然細(xì)胞是一樣的,但是細(xì)胞的狀態(tài)不一定一樣。對于狀態(tài)不一樣的細(xì)胞,建議每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
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