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1．為什么需要新鮮的菌液？

首先，新鮮的菌液易于培養(yǎng)，可以獲得更多的DNA，同時最大限度地保證菌種的純度。

2．如何提供菌液？

如果您提供新鮮菌液，用封口膜封口以免泄漏；也可以將培養(yǎng)好的4～5ml菌液沉淀下來，倒去上清以方便郵寄。同時郵寄時最好用盒子以免郵寄過程中壓破。

3．如何制作穿刺菌？

用滅菌過1.5ml或2ml離心管加入LB瓊脂(7g/L)斜面凝固，用接種針挑取分散良好的單菌落穿過瓊脂直達管底，不完quan蓋緊管蓋適當溫度培養(yǎng)過夜，然后蓋緊蓋子加封口膜，室溫或4度保存。

4． PCR產(chǎn)物直接測序有什么要求？

（1) 擴增產(chǎn)物必須特異性擴增，條帶單一。如果擴增產(chǎn)物中存在非特異性擴增產(chǎn)物，一般難以得到好的測序結(jié)果；

(2）必須進行膠回收純化；

(3）DNA純度在1.6—2.0之間，濃度50ng/ul以上。

5．為什么PCR產(chǎn)物直接測序必須進行Agarose膠純化？

如果不進行膠純化而直接用試劑盒回收，經(jīng)常會導致測序出現(xiàn)雙峰甚至亂峰，這主要是非特異性擴增產(chǎn)物或者原來的PCR引物去除不干凈所導致。

大多所謂的PCR“純化試劑盒"實際上只是回收產(chǎn)物而不能起到純化的作用的。對于非特異性擴增產(chǎn)物肯定無法去除，而且通常他們不能夠完quan去除所有的PCR引物，這會造成殘留的引物在測序反應過程中參與反應而導致亂峰。

6．如何進行PCR產(chǎn)物純化？

PCR產(chǎn)物首先必須用Agarose膠電泳，將特異擴增的條帶切割下，然后純化。使用凝膠回收試劑盒回收，產(chǎn)物用ddH2O溶解。

7． PCR產(chǎn)物直接測序的好處？

（1) PCR產(chǎn)物直接測序可以反映模板的真實情況；

（2) 省去克隆的實驗費用和時間；

（3) PCR產(chǎn)物測序正確的片段進行下一步克隆實驗使結(jié)果更有保障；

（4) 混合模板進行PCR的產(chǎn)物直接測序可以發(fā)現(xiàn)其中的點突變。

8．對用于測序的質(zhì)粒DNA的要求有哪些？

對測序模板DNA的一般要求：

（1)DNA純度要求高，1.6—2.0之間，不能有混合模板，也不能含有RNA，染色體DNA，蛋白質(zhì)等；

（2)溶于ddH2O中，溶液不能含雜質(zhì)，如鹽類，或EDTA等螯合劑，將干擾測序反應正常進行。

9．如何鑒定質(zhì)粒DNA濃度和純度？

我們使用水平瓊脂糖凝膠電泳，并在膠中加入0.5ug/ml的EB(電泳緩沖液中不必加EB)，加一個已知濃度的標準樣品。電泳結(jié)束以后在紫外燈下比較亮度，判斷濃度和純度。此方法可以更直接、準確地判斷樣品中是否含有染色體DNA、RNA等，也可以鑒別抽提的質(zhì)粒DNA的不同構(gòu)型。

質(zhì)粒DNA的3種構(gòu)型是指在抽提質(zhì)粒DNA過程中，由于各種原因的影響，使得超螺旋的共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒(SC)的一條鏈斷裂，變成開環(huán)狀(OC)分子，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就變成為線狀(L)分子。

這3種分子有不同的遷移率，通常，超螺旋型(SC)遷移速度最快，其次為線狀(L)分子，最慢為開環(huán)狀(OC)分子。

使用紫外分光光度計檢測，或者用溴乙錠-標準濃度DNA比較法只能檢測抽提到的產(chǎn)物中的濃度，甚至由于抽提的質(zhì)粒DNA中含有RNA、蛋白質(zhì)、染色體DNA等因素的干擾，濃度檢測的數(shù)值也是沒有多少意義的。

10．為什么抽提的質(zhì)粒最好溶解在ddH2O中？

全自動熒光測序由于反應體系小，所以對于模板DNA的質(zhì)量要求比手工測序高許多。通常的提取質(zhì)粒的試劑盒會提供一個Elution Buffer給用戶洗脫DNA，我們建議用戶不要使用。因為其中含有的如EDTA等組分會對測序反應產(chǎn)生干擾，甚至導致測序反應失敗。

11．對測序引物的要求有哪些？

對測序引物的一般要求：

(1)特異性與測序模板結(jié)合，不能有多于4個堿基以上的錯配現(xiàn)象；

(2)不能含有混合堿基；

(3)長度17-25堿堿；

(4)純度高，最好PAGE純化；

(5)用ddH2O溶解，不要用TE溶解。

12．為什么測序引物必須特異地與DNA模板結(jié)合？

測序引物與待測樣品DNA分子只能有一個結(jié)合位點是測序成功的前提。如果測序引物在DNA模板分子上有不只一個的結(jié)合位點，將造成測序反應過程中引物鏈在幾個結(jié)合位點處同時擴增，從而得到鏈長相同而組成不相同的終止鏈，測序電泳時收集到重疊峰或亂峰，無法讀取序列

13．為什么測序引物3'端以后有30-50堿基無法讀到？

全自動熒光測序方法由于使用標記了大熒光染料的ddNTP，一些未反應完的ddNTP底物會連同測序反應產(chǎn)物一并被沉淀，在測序電泳時會干擾測序信號，導致這部分堿基無法讀清。

一般的我們會在分析結(jié)果時切掉這部分無意義的數(shù)據(jù)。通常這也是載體的序列。所以選取測序引物時要使引物3'端離開要求測序的起始位置50bp以上比較合適。而對于PCR產(chǎn)物測序就不可避免使得測序引物區(qū)域附近無法讀到數(shù)據(jù)。

14.為什么在測序報告上找不到引物序列？

有如下幾種情況:

（1）找不到測序所用的引物序列。這是正常的，因為熒光測序方法采用的是熒光標記了的ddNTP，自動測序儀通過檢測ddNTP上的熒光來讀取序列。由于引物本身是不被標記的，所以在測序結(jié)果中也是找不到的。

（2）找不到克隆片段的擴增引物。原因可能是您在構(gòu)建質(zhì)粒時所用的酶的酶切位點距離您的測序引物太近，由于熒光染料的干擾在序列開始的部分判讀不清。

（3）還有一種可能是您的插入片段的插入方向是反的，這時可以找一下引物的互補序列。

（4）存在單引物擴增，有一條引物的特異性不好，有多個結(jié)合位點，導致只有一條引物參與擴增。

15．什么是Primer Walking 測序？

大于片斷較大的樣品，雙向測序如果不能完quan拼接，我們還可以為用戶按照上一個測序結(jié)果在一定的位置左右設計引物繼續(xù)測序，并將測序結(jié)果拼接，即Primer Walking 測序。

16．超過6Kb的DNA片斷如何進行測序？

超過6Kb的DNA片斷用Shot Gun 進行測序準確并且節(jié)省時間， Shot Gun方法如下：

（1）用物理方法打碎DNA；

（2）回收1～1.5Kb的片斷；

（3）用核酸酶切平端，連接入載體；

（4）按照一定比例進行測序，保證每一個區(qū)段有3倍以上的數(shù)據(jù)；

（5）編輯所有測序數(shù)據(jù)；

（6）如果有缺少數(shù)據(jù)的區(qū)域，還需要補充測序。拼接成完整序列。

17.為什么測序結(jié)果完quan不是所需的序列？

出現(xiàn)這樣的情況只有兩種可能：

（1）我們給您的測序結(jié)果對應的不是您的樣品；

（2）您的樣品插入部分與您預期的不一致。

這時需要雙方將樣品進行驗證（PCR和酶切鑒定）。

18.樣品送測序前已經(jīng)鑒定過了，有插入片段的，為什么測序結(jié)果是一個空質(zhì)粒？

測序是對樣品的最好驗證.結(jié)果為空載，可能如下：

（1）可能在培養(yǎng)過程中發(fā)生插入片段的丟失，由于這種情況的發(fā)生無法事先預期到；

（2）提供的克隆是假陽性克隆。