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快速了解制備型液相色譜
  • 更新日期:2023-03-15      瀏覽次數(shù):563
    • 1)低壓液相色譜;(2)中壓液相色譜;(3)高壓液相色譜;(4)快速色譜。低壓、中壓與高壓液相色譜的壓力范圍之間會存在一定交疊,沒有統(tǒng)一、明確的標(biāo)準(zhǔn)。

      1.快速色譜
      柱壓通常為2bar(或30psi)左右,對于那些容易分離的簡單混合物,由于快速色譜具有操作簡便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn),常常是實驗室的。但快速色譜不同于一般的層析分離,這種分離沒有壓力,而快速分離通常使用瓶裝氮?dú)饧訅?,使流動相具有一定的流速,從而縮短了分離時間。

      快速色譜使用的柱子一般是玻璃柱,柱直徑為3~10cm.長度為7~15cm。快速色譜中使用zui廣泛的固定相為硅膠。采用的粒徑通常為:25~40μm,40~63μm或63~200μm的球形固定相。其它如鍵合相、氧化鋁、聚酰胺吸附劑也常用作快速色譜的固定相使用。

      2.低壓色譜(LPLC)
      柱壓一般低于5bar(或75psi)。

      低壓色譜一般是由蠕動泵、進(jìn)樣閥和檢測器組成,可以連續(xù)化,實現(xiàn)自動的梯度淋洗和餾分收集等操作。色譜柱管一般是玻璃或聚合物材料的,長度一般為240-440mm,內(nèi)徑為10-40mm。

      對于大多數(shù)在紫外區(qū)有吸收的物質(zhì),光學(xué)檢測器很常用。填料一般使用軟質(zhì)的葡聚糖、瓊脂糖、纖維素、合成高聚物或離子交換劑,粒徑一般為40-60μm。

      3.中壓液相色譜(MPLC)
      柱壓在5-20bar(或75-300psi)之間,廣泛用于實驗室和工業(yè)規(guī)模的生物制品(如動物臟器提取液、濃縮液、體液、植物提取液、生物技術(shù)發(fā)酵液等--往往需要經(jīng)過濾膜作初級凈化)的處理,以提取或純化所需的產(chǎn)品。

      中壓液相制備色譜的主要部件為輸液泵、進(jìn)樣閥、檢測器、餾分收集器等,早期的中壓液相制備色譜,其輸液泵zui大流速可達(dá)156mL/min,并配有阻尼器,以保證液流的穩(wěn)定;進(jìn)樣器配有0.5-50mL的不同體積的定量管;檢測器有紫外和示差折光檢測器,流通池體積比較大,允許大流量流動相通過而無需分流;餾分收集器有原盤式和排式兩種,原盤式的接收管zui多達(dá)80個,而后者則更多;色譜柱內(nèi)徑9-105mm,長度250-1760mm不等。

      對于一般中壓制備色譜,當(dāng)色譜柱直徑較大時,柱頭往往設(shè)計成錐形或有類似于傘狀的液流導(dǎo)向結(jié)構(gòu),使得當(dāng)大量樣品進(jìn)入到柱頭上時,能迅速地分散到整個柱橫截面上,及時被流動相沖走,避免了因樣品的局部過濃而引起柱超負(fù)荷和譜帶加寬。柱子填料則采用比較耐壓的交聯(lián)改性的多糖凝膠(如Sepharose CL,Superose等),聚合物微球,復(fù)合材料介質(zhì)或硬質(zhì)SiO2基體的化學(xué)鍵合相等,粒徑一般在25~40μm(zui常用的填料尺寸是15-25μm,25-40μm或40-63μm),可采用濕法或干法裝柱。

      4.高壓液相色譜(HPLC)

      是指柱壓一般大于20bar(或300psi)的“高壓(或)液相色譜",通常指所用色譜柱的塔板數(shù)大于2000,一般是在2,000~20,000的范圍之間。

      當(dāng)需要從大量的物質(zhì)中分離純化不足1%的所需成分時,分離工作將會十分困難,往往在純化的zui后階段需要使用10μm或更小顆粒的填料。為獲得所需微量組分,可采用如下分離手段:制備型分離→半制備型分離→分析型分離→產(chǎn)物。為提高每次分離獲得純品的數(shù)量,制備型高壓液相色譜分離通常在超載情況下運(yùn)行。

      高壓液相色譜,即目前常用的液相色譜。色譜柱內(nèi)填裝的是粒度范圍較窄的微小顆粒固定相(3~30μm),為使流動相流出,需采用較高的壓力,同時系統(tǒng)的復(fù)雜性及成本亦增大,但分辨率可得到較大的提高。而填裝較大顆粒的固定相時,如中壓液相色譜系統(tǒng),裝柱較容易,柱的通透性較高(只需較低的泵壓力),可采用更大的色譜柱和更經(jīng)濟(jì)的儀器,由此分辨率也較低。

      5.用分析型高壓液相色譜進(jìn)行制備型分離

      當(dāng)所需純化合物的量很少時(微克級至幾毫克),可用分析型色譜柱進(jìn)行多次分離。效果和利用大直徑色譜柱進(jìn)行一次性分離相同。采用小直徑色譜柱時,可利用已有的分析型儀器,而無需在色譜柱、填料及附件方面投入更大資金;另外,還可在很大程度上避免由于放大所產(chǎn)生的問題,使分離速度加快。

      小直徑色譜柱的尺寸一般為250×4.6mm,通常裝有反相填料,每次可進(jìn)樣5~100ug,通過多次進(jìn)樣分離,可獲得足夠的純品。例如,Suzuki等(1994)報道從豆科植物羽扇豆(Lupinus Hirsutus)中分離一羽扇豆生物堿糖苷時,其zui后的分離步驟采用LiChrosorb Si60,5μm,250×4.6mm色譜柱進(jìn)行高壓液相色譜分離,洗脫劑為含25%甲醇的yi醚溶液-5%氨/水50:1。

      經(jīng)常需用分析型色譜柱進(jìn)行分離的一個領(lǐng)域是對肽類化合物的純化。生物活性肽的含量通常很低,用分析型高壓液相色譜作為zui后的純化手段時,不會使色譜柱超載。

      為了提高分離效率,可將分析型高壓液相色譜柱連接起來使用。此時可采用顆粒度在20~30μm的填料,以保持適當(dāng)?shù)耐ㄍ感裕绕涫钱?dāng)使用含水溶劑時。當(dāng)使用己烷等有機(jī)溶劑時,由于流動相的粘度較低,可使用顆粒度為10μm的填料。

      然而由于分析型色譜系統(tǒng)無法提供大規(guī)模制備型分離所需的流速,其應(yīng)用受到一定限制。